涂料中的纳米颗粒与原生纳米颗粒在小鼠体内的毒性

纳米材料独特的物理和化学性质使得它在越来越多的工业应用中被使用，漆料添加剂中也广泛使用了纳米材料。例如，二氧化钛（TiO₂）工程纳米颗粒（ENP）具有良好的抗UV，自清洁和空气净化效果。银（Ag）ENPs以其抗微生物能力而闻名，二氧化硅（SiO₂）ENP用作阻燃剂和抗刮涂层。本研究比较了三种原始ENPs（TiO₂，Ag和SiO₂），实验将含有ENPs（TiO₂，Ag和SiO₂）的三种老化涂料与不含ENPs的对照涂料的毒性效应和生物分布进行对比。用ENP或油漆颗粒（20μg/吸出）让BALB / c小鼠口咽吸入，每周一次，持续5周，并在最后抽吸治疗后2或28天令其死亡。进行支气管肺泡灌洗，评估全身血液毒性，并完成炎症细胞诱导因子和关键的血液参数的细胞计数。此外，提取出肺，肝，肾，脾和心脏并测定金属浓度。

原始ENPs在肺中引起的影响较小，在血液中引起的改变也可以忽略不计。在吸入含有Ag ENPs的气体后观察到的毒性作用最显著；测定了嗜中性粒细胞和促炎细胞因子分泌物（角化细胞化学引诱物（KC）和白细胞介素-1β（IL-1β））的量增加了两倍以上。含有TiO₂ ENP的涂料不改变巨噬细胞和嗜中性粒细胞计数，但轻度诱导KC和IL-1β。含有Ag或SiO₂的涂料没有显示显着的毒性。生物分布实验显示吸入Ag或SiO₂ ENPs后，Ag和Si在肺外的分布。总提来讲，该研究证明即使直接暴露于ENPs环境下能够诱导出一些毒性作用，但当他们被嵌入一个复杂的油漆基质后，期不良的毒理作用被大幅度降低甚至微乎其微。

工程纳米粒子（ENPs）的当前应用覆盖广泛的工业和消费部门，包括化妆品，药物和材料科学。在结构领域，ENP可以改善重要的材料特性，例如提高强度和耐久性，同时降低总重量。 ENP还显示出对材料添加有用的性质，包括热，自清洁和防雾效果。 ENPs在木材，金属，陶瓷，天然石材，混凝土，复合材料和塑料的新涂料和涂料体系的开发中也显示了作为涂料添加剂的巨大潜力。在工业应用方面，涂料，涂料和颜料是ENPs在总体使用方面的最重要的应用。

在油漆和涂料中使用的三种最普遍的ENP是二氧化钛（TiO₂），银（Ag）和二氧化硅（SiO₂）。 2008年Mueller和Nowack的一项研究表明，在欧洲，35％的纳米Ag生产和25％的纳米TiO₂生产被涂料和涂料行业使用，使该行业成为纳米Ag的第一个终端用户，纳米TiO₂的第二终端用户。纳米TiO₂的光催化和疏水性质产生具有自清洁，空气净化和抗UV性能的涂层。纳米Ag替代化学杀菌剂的抗菌效率，而添加纳米二氧化硅将增加涂料和涂料的耐划伤性和耐火性。目前在油漆和涂料中使用的其它ENP主要来源于具有自清洁和抗UV性能的氧化锌（ZnO），以及以耐火性和高拉伸强度见长的碳纳米管。

油漆和涂料中使用的ENP接触可能在生产过程中或当涂覆涂层时发生。气体吸入是最可能的接触途径，特别是当涂料通过喷涂应用通常在涂料工业中进行时。同时，材料的老化过程例如长时间暴露在UV环境中，热应力作用，水损坏和划痕或在砂磨、钻孔过程中暴露在空气中。此外，在空间狭小缺乏通风的室内，毒性物质的含量要比室外环境更高。

ENPs的毒性是过去几年的主要研究焦点。但当它们嵌入复杂的涂料或涂料基质中后，人们对它们的毒性了解却并不多。在本研究中，比较了三种原始ENPs（TiO2，Ag和SiO2），含有ENPs（TiO2，Ag和SiO2）的三种老化涂料与不含ENPs的对照涂料的炎症和毒性作用。通过口咽吸入使小鼠肺部与有毒物质接触。此外，通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）评估原始ENP和包含ENP的老化涂料对不同器官（肺，肾，脾，肝和心脏）造成的影响。我们的研究结果表明，虽然接触原始ENPs确实能够诱发毒性反应，但在油漆基质阻止了大多数颗粒的毒性传递。

材料和方法

材料

含有（TiO₂，Ag和SiO₂）ENPs的涂料和没有ENPs的对照涂料由工业项目合作伙伴提供。

异氟烷（Forene）获自Abbott Laboratories（SA Abbott NV，Ottignies，Belgium）。

戊巴比妥（Nembutal），来自SanofiSantéAnimale （CEVA，Brussels，Belgium）。

制造老化的粉末涂料颗粒

使用涂膜器将液体涂料施加在塑料板上，产生200μm厚的均匀膜。在室温（20℃）下干燥24小时后，使用金属刮刀手动除去油漆以获得粉末涂料。这些粉末使用行星式球磨机研磨，最后暴露于UV-A（Philips TL20W / 09N）500小时（64个亮度循环，光暗时间4h-4h ）式材料老化。

粒子表征

扫描电子显微镜

将老化的涂料粉末沉积在用自粘碳标签（G3347N，Agar Scientific，Essex，UK）覆盖的铝柱上。在金溅射之后，通过扫描电子显微镜（SEM）（Jeol JSM-6610 LV，加速电压：10kV，工作距离：10mm）表征涂料颗粒。

动态光散射

在ALV / CGS 3仪器（ALV，Langen，德国）上进行多角动态光散射（DLS）测量。为了避免任何可能的污染，用过滤的丙酮（450nm Chromafil PTFE过滤器）清洁毛细管，并在测量前在110℃下干燥。将样品置于超声浴中15分钟，并在测量前插入5分钟以允许温度稳定。在30°至150°的散射角度下以15°的步长执行几组60s的DLS测量，波长为632.8nm。这种多角度方法将允许校正由颗粒各向异性和/或多分散性导致的散射强度的角度依赖性。强度自相关函数的建模使用累积方法（如果适用）和用最大熵方法进行交叉检查。

ζ电位

ζ电位测量在ZetaPlus zeta电位分析仪上进行，用ZetaPALS选项扩展。 PALS（相位分析光散射）比基本ZetaPlus设置中使用的Doppler方法更灵敏。在DLS测量之后回收ζ电势测量的样品，并使用Smoluchowski模型分析获得的结果。

老鼠

雄性BALB / c OlaHsd小鼠（6周龄）。将小鼠饲养在具有12-h暗/光循环的常规动物房中。将它们容纳在过滤器顶笼中并且随意接受轻微酸化的水和颗粒状食物。所有实验程序由当地动物实验伦理委员会批准。

实验方案

在第0,7,14,21和28天，在光异氟烷麻醉下接受原始ENP的口咽吸入（25μl），含有ENP的老化的涂料颗粒，控制老化的涂料颗粒（0.8mg / ml）或赋形剂盐水（0.9％NaCl））。在最终抽吸治疗（第30天）后2天通过腹膜内注射戊巴比妥（90mg / kg体重）处死小鼠。暴露于原始ENP或载体的第二组小鼠在最终抽吸治疗（第56天）后28天处死。实验方案的示意图如图1所示。

图1：实验设计示意图。

 在第0,7,14,21和28天通过在异氟醚麻醉下口咽吸入将小鼠暴露于不同的颗粒。

在第30或56天进行尸体解剖。

肺部炎症（支气管肺泡灌洗）

在用0.4ml无菌盐水（0.9％NaCl）原位灌注右肺之前夹住左肺支气管三次，收集回收的液体。使用Bürker血细胞计数器计数总细胞，并将支气管肺泡灌洗（BAL）流体离心（1000g，10分钟）。通过分光光度监测丙酮酸盐的还原在上清液中测定乳酸脱氢酶，将剩余的上清液冷冻（-80℃）直至进一步分析。对于白细胞亚群的细胞计数，将250μl重悬浮的颗粒（100,000细胞/ ml）旋转（300g，6分钟）到显微镜载玻片上，空气干燥。对于每个样品，对200个细胞计数巨噬细胞和嗜中性粒细胞的数目。在冷冻上清液解冻后，使用Bio-Rad蛋白质测定，根据Bradford方法测定总蛋白质水平。

细胞因子

取出两片左肺叶，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直至进一步分析。在均质化的肺组织中用小鼠炎症因子7测量炎性细胞因子（白介素-1β（IL-1β），IL-12p70，IFN-γ，IL-6，角质形成细胞化学引诱物（KC），IL-10和TNF- -Plex Ultra-Sensitive Kit。

金属浓度

通过ICP-MS在另一肺片，肾，脾，肝和心脏中测量Ti，Ag和Si浓度。将1毫升硝酸（HNO 3）60％ultrapur加入〜30mg组织或3-4mg涂料颗粒中，并在140℃下加热5小时。最后，将样品在Milli-Q水中稀释至10ml，并通过ICP-MS（Agilent 7700x ICP-MS）测量Ti，Ag和Si浓度。使用Ge和Rh作为内标，测量元素为47Ti，107Ag和28Si。溶液中的定量限为0.15μg/ l（Ag和Ti）或15μg/ l（Si）。

系统性炎症（血液参数）

从眶后丛收集血液。在Cell-Dyn 3500R计数器（Abbott，Diegem，Belgium）上进行血细胞计数和差异。将全血离心（14,000g，10分钟）后获得的血浆样品储存在-80℃直至进一步分析。使用Mouse ProInflammatory 7-Plex Ultra-Sensitive Kit在血浆中测量炎性细胞因子（IL-1β，IL-12p70，IFN-γ，IL-6，KC，IL-10和TNF- Gaithersburg）。

数据分析

所有数据表示为平均值和标准偏差（SD）。使用非参数Kruskal-Wallis检验，随后通过Dunn多重比较检验（分析所有数据。 p<0.05的水平被认为是显着的。